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TRF、TR-FRET 和 HTRF

TRF/TR-FRET (HTRF) 概述

时间分辨荧光 (TRF)

使用荧光素等传统荧光基团检测荧光强度 (FI) 时,荧光素的发射寿命很短,大约只有数纳秒。样品的激发和发射会同时检测。尽管微孔板读板机很擅长从发射光中筛选出激发光,但这种激发光和板材或样品中物质的短寿命自发光经常会一起导致高背景。

时间分解荧光 (TRF) 通过使用铕或铽等能够发射长寿命荧光的镧系元素荧光基团来降低背景。这种长寿命荧光可荧光基团持续数毫秒,因此使用脉冲光源(如闪光灯)激发荧光团,激发之后隔一段时间再进行信号测量(“计数窗”)。可使短寿命荧光(仅持续数纳秒)在测量之前消失。使用时间分辨荧光进行检测可大大降低信噪比。最常使用的镧系元素是铕、铽和钐。这些通常以螯合物或穴合物的形式应用以获得优质的信号强度和稳定性。

 

 

时间分辨荧光

时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET)

 

htrf-camp

非 FRET

供体和受体相隔很远

FRET

供体和受体相隔很近

TR-FRET结合了荧光的时间分辨检测技术和荧光能量共振转移(FRET)技术。在FRET实验中,生物分子(如蛋白等)被荧光基团供受体标记。当生物分子之间相互作用,供受体荧光基团的距离被拉近。此时,若供体被激发,它会传递它的发射光能量给受体。受体和供体的发射光具有不同的波长,可以被微孔板读板机区分,从而定量生物分子之间的相互作用。

使用镧系元素荧光基团作为供体,发射光有很长的寿命,TR-FRET利用时间分辨检测荧光去消除短寿命背景荧光的干扰。在TR-FRET实验中,由于供体荧光基团发射光有长寿命,供受体荧光基团的激发和发射都可以在短寿命背景荧光消失后再检测。

均相时间分辨荧光 (HTRF)

TR-FRET

HTRF是一种通用的TR-FRET技术,该技术由Cisbio发明用于检测生物分子间的相互作用。典型的 HTRF 检测把铕穴状化合物用作供体,把有机荧光团 d2 用作受体。供体和受体可以被用于标记各种生物分子,应用范围包括表观遗传学,生物标志物定量,GPCR信号转导等。HTRF 检测需要一个经 Cisbio 认证能兼容 HTRF 的带 TRF 检测模式的微孔板读板机。

客户研究的重大突破

iTeos 使用我们的多功能微孔读板机(酶标仪)来确定针对肿瘤免疫微环境的疗法

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优势和注意事项

与传统荧光相比,TRF 和 TR-FRET 检测的主要优点包括背景降低和信噪比升高,因此可提高灵敏度。此外,该检测技术还有一种强大的混合-读数模式,无需进行任何清洗步骤。这一点连同实验的稳定性,使该技术很容易实现自动化和小型化筛选类应用。

 

应用和检测

TRF 和 TR-FRET (HTRF) 检测可分析生物化学过程中的分子相互作用,且被广泛用于研究激酶检测、细胞信号转导通路、蛋白相互作用、DNA 与蛋白的相互作用、细胞毒性以及受体与配体的结合。

TR-FRET 检测示例的概述见右表,几种时间分辨荧光资源见下文。
 

分析测定 供体 受体 波长
HTRF-Eu/红色* 铕穴状化合物 XL665 或 d2 Ex320 Em1 620/Em2665
HTRF-Tb/红色* 铽穴状化合物 XL665 或 d2 Ex340 Em1 620/Em2665
HTRF-Tb/绿色* 铽穴状化合物 荧光素或 GFP Ex340 Em1 620/Em2520
Lanthascreen Tb** 铽螯合物 荧光素 Ex340 Em1 490/Em2520
Lanthascreen EU** 铕螯合物 Alexa Fluor647 Ex320 Em1 620/Em2665
LANCE(原装)*** 铕螯合物 Surelight® APC Ex320 Em1 620/Em2665
LANCE Ultra*** 铕螯合物 ULight Ex320 Em1 620/Em2665

  • 利用HTRF技术检测人源 TNFα

    利用HTRF技术检测人源 TNFα

    人源TNFα 检测试剂盒可直接对 TNFα 进行定量检测。它使用一种夹心免疫测定,其中涉及两种特异性抗体:一种是用 Eu 穴状化合物标记的抗 TNFα,另一种是用 XL665 或 d2 标记的抗 TNFα。在有 TNFα 的情况下,这两种抗体都能结合 TNFα,使得两种标记相互靠近,从而发生 TRFRET(图 1)。信号与样品中抗原的浓度成比例。

    在本应用说明中,我们展示了 SpectraMax® Paradigm® 多功能微孔读板机(酶标仪)如何进行强大的免洗细胞因子检测并伴随优异的 Z' 因子。

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    利用HTRF检测细胞因子,结合细胞活性综合评价

    利用HTRF检测细胞因子,结合细胞活性综合评价

    促炎性和抗炎性细胞因子在自身免疫性和炎症性以及传染性疾病方面发挥主要作用。它们还在代谢性疾病和肿瘤中起着关键作用,尤其是在抗肿瘤免疫应答中。Cisbio Bioassays 的均相时间分辨荧光 (HTRF) 为各种细胞因子和趋化因子的定量提供了一个通用平台。

    本应用说明显示了如何使用带 SpectraMax® Minimax® 300 成像细胞计数器的 SpectraMax i3x® 多功能微孔板读板机来进行细胞因子分泌和细胞活性的相关分析。

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  • 测定氧化应激和糖酵解活性

    测定氧化应激和糖酵解活性

    为了存活,细胞需要三磷酸腺苷 (ATP) 形式的燃料来执行最基本的生物过程。这种燃料通过糖酵解和线粒体呼吸作用产生。尽管二者都能产生 ATP,但糖酵解在缺氧时仍然起作用,而线粒体则需要氧气才能进行氧化磷酸化 (OXPHOS) 的最后一步。

    本应用说明的优点:

    • 实时测定细胞外耗氧和细胞及微生物的酸化
    • 两个样本灵敏的TRF检测,简单的混合-读数工作流程。
    • 预配置的 SoftMax Pro 实验步骤可加快数据采集和分析

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    HTRF cAMP dynamic 2 和 IP-One 检测

    HTRF cAMP dynamic 2 和 IP-One 检测

    此处用 cAMP dynamic 2 和 IP-One 两种不同的 HTRF 检测试剂盒说明了 HTRF 检测在 SpectraMax M5e 读板机上的性能。G-蛋白偶联受体通过调节 cAMP 和增加 IP3 介导的细胞内钙水平这两个主要途径发出信号。借助 cAMP dynamic 2 试剂盒,使用 Eu 穴状化合物标记的单克隆抗 cAMP 抗体和 d2 标记的 cAMP 可检测 cAMP 水平。IP-One 检测的形式与之相似,使用一种对 IP1 特异性的单克隆抗体,一种更稳定的 IP3 下游代谢物,这种代谢物在有氯化锂的情况下会在信号转导细胞中聚集。

    本应用说明描述了使用 cAMP dynamic 2 和 IP-One 试剂盒时生成的细胞检测数据和标准曲线。这些 HTRF 数据显示了使用 SpectraMax M5e 读板机时能获得的绝佳动态范围和 Z' 因子 2。

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  • HTRF cAMP HiRange 检测

    HTRF cAMP HiRange 检测

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    HTRF cAMP HiRange 试剂盒可对细胞样品中的环磷酸腺苷(cAMP:环腺苷酸 3’, 5’-单磷酸盐)进行定量。cAMP 是 G-蛋白偶联受体 (GPCR) 信号转导中的一个关键第二信使。配体结合 GPCR 后会发生构型改变,从而激活受体,转而激活 G 蛋白。

    在本应用说明中,我们揭示了如何使用 SpectraMax® 多功能微孔板读板机来进行可靠的高通量 HTRF® 检测,并获得优良的 Z’ 因子和高度可重复的 EC50 值。

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    用于 Transcreener TR-FRET 检测的优化设置

    Transcreener TR-FRET 检测

    Transcreener® TR-FRET 检测属于单步骤竞争性免疫测定,可使用远红外时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 读数直接检测核苷酸。了解如何在 SpectraMax iD5 和 i3x 多功能微孔板读板机上优化用于 Transcreener TR-FRET 检测的设置。

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  • 用于高通量 cAMP 检测的基于钌的 TRF 检测

    基于钌的 TRF 检测

    与耗时费力的传统免疫测定法相比,单步骤、免洗的均相免疫测定法已引起研究人员的高度关注。本研究中,我们报告了一种基于钌的时间分辨荧光法,用于在研究和药物发现领域高通量检测cAMP。

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    定制钌 Nano-TRF 检测平台

    钌 Nano-TRF 检测平台

    新闻:Molecular Devices 与 Roche 合作开发定制钌 Nano-TRF 检测平台

    Molecular Devices 的定制技术小组已与 Roche 医药研发部 (pRED) 的发现技术小组展开合作,开发一种用于药物发现筛选的高通量检测系统,该系统使用 Roche 的专有钌纳秒时间分辨荧光 (Nano-TRF®) 检测。pRED 筛选小组正在将定制开发的 Nano-TRF® 卡盒安装在现有的 Molecular Devices SpectraMax® Paradigm® 多功能微孔板读板机中。

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时间分辨荧光 (TRF) / TR-FRET (HTRF) 资源

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