TRF、TR-FRET 和 HTRF

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TRF/TR-FRET (HTRF) 概述

时间分辨荧光 (TRF)

使用荧光素等传统荧光基团检测荧光强度 (FI) 时，荧光素的发射半衰期很短，大约只有数纳秒。样品的激发和发射光的检测会同时进行。尽管微孔板读板机可以将发射光中的激发光筛选后有效去除，但这种激发光干扰、微孔板材质和待检测物质自发光等短半衰期光信号经常会干扰待检测荧光信号，导致高背景。

时间分辨荧光 (TRF) 通过使用铕或铽等能够发射长半衰期荧光信号的镧系元素作为荧光基团来降低背景信号值干扰。这种长半衰期荧光信号可持续数毫秒，因此可以使用脉冲光源（如氙闪灯）激发荧光基团，隔一段时间再进行发射信号检测（“计数窗”）。短半衰期荧光（仅持续数纳秒）在信号检测之前就会消失。使用时间分辨荧光进行测定可大大降低信噪比。最常使用的镧系元素是铕、铽和钐。这些镧系元素通常以螯合物或穴合物的形式应用以获得优质的信号强度和稳定性。

时间分辨荧光 (TRF)

时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET)

非 FRET

供体和受体相隔很远

FRET

供体和受体相隔很近

TR-FRET 结合了时间分辨荧光检测技术和荧光能量共振转移检测 (FRET) 技术。在 FRET 实验中，生物分子（如蛋白等）被荧光基团供受体标记。当生物分子之间相互作用，供受体荧光基团的距离被拉近。此时，若供体被激发，它会传递它的发射光能量给受体。受体和供体的发射光具有不同的波长，可以被微孔板读板机区分，从而定量生物分子之间的相互作用。

使用镧系元素荧光基团作为供体，发射光有很长的半衰期，TR-FRET 可以利用时间分辨检测荧光，消除短半衰期背景荧光的干扰。在 TR-FRET 实验中，由于供体荧光基团发射光有较长半衰期，供受体荧光基团的激发和发射都可以在短半衰期背景荧光消失后再检测。

均相时间分辨荧光 (HTRF)

HTRF 是一种通用的 TR-FRET 技术，该技术由 Cisbio 发明，用于检测生物分子间的相互作用。典型的 HTRF 检测把铕穴状化合物用作供体，有机荧光团 d2 用作受体。供体和受体可以被用于标记各种生物分子，应用范围包括表观遗传学，生物标志物定量，GPCR 信号转导等。HTRF 检测需要一个经 Cisbio 认证能兼容 HTRF 的带 TRF 检测模式的微孔板读板机。

客户研究的重大突破

iTeos 使用我们的多功能微孔板读板机（酶标仪）来确定针对肿瘤免疫微环境的疗法

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优势和注意事项

与传统荧光检测技术相比，TRF 和 TR-FRET 检测的主要优点包括降低背景和提高信噪比，因此可提高灵敏度。此外，该检测技术还有一种强大的混合-读数模式，无需进行任何清洗步骤。这一优点连同实验的稳定性，使该技术非常适用于自动化和小型化筛选类应用。

应用和检测

TRF 和 TR-FRET (HTRF) 检测可分析生物化学过程中的分子相互作用，被广泛用于研究激酶、细胞信号转导通路、蛋白相互作用、DNA 与蛋白的相互作用、细胞毒性以及受体与配体的结合。

TR-FRET 检测示例的概述见右表，几种时间分辨荧光资源见下文。

细胞因子检测
电子书：从 ELISA 到 HTRF 表观遗传学
HTRF cAMP 检测，G_αi/o 偶联受体
HTRF cAMP 检测，G_αs 偶联受体
HTRF 检测
适用于均相时间分辨荧光 (HTRF) 的微孔板读板机
IP-One 检测，G_αq/11 偶联受体
激酶和表观遗传学检测
测定氧化应激和糖酵解活性
用于 Transcreener TR-FRET 检测的优化设置

分析测定	供体	受体	波长
HTRF-Eu/红色^*	铕穴状化合物	XL665 或 d2	Ex320 Em1 620/Em2665
HTRF-Tb/红色^*	铽穴状化合物	XL665 或 d2	Ex340 Em1 620/Em2665
HTRF-Tb/绿色^*	铽穴状化合物	荧光素或 GFP	Ex340 Em1 620/Em2520
Lanthascreen Tb^**	铽螯合物	荧光素	Ex340 Em1 490/Em2520
Lanthascreen EU^**	铕螯合物	Alexa Fluor647	Ex320 Em1 620/Em2665
LANCE（原装）^***	铕螯合物	Surelight® APC	Ex320 Em1 620/Em2665
LANCE Ultra^***	铕螯合物	ULight^™	Ex320 Em1 620/Em2665

细胞因子检测

促炎性和抗炎性细胞因子在自身免疫性和炎症性以及传染性疾病方面发挥主要作用。它们还在代谢性疾病和肿瘤（尤其是在抗肿瘤免疫应答过程中）发挥关键作用。HTRF 检测为各种细胞因子和趋化因子的定量提供了一个通用平台，适用于在细胞实验中监测细胞因子和趋化因子的释放。凭借 SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机和 SpectraMax® MiniMax™ 300 成像型细胞计数仪，用户能够测定 HTRF 和细胞活性，并通过监测细胞外观来确认检测质量。

探索我们的细胞因子检测资源：

应用说明： 将 HTRF 细胞因子检测标准化为细胞活性
应用说明： 在 SpectraMax Paradigm 多功能微孔板读板机上进行 HTRF 人 TNFα 检测
电子书： 彻底了解细胞

电子书：从 ELISA 到 HTRF 表观遗传学

使用优化的微孔板读板机设置和简化的分析克服 HTRF 检测挑战。

轻松进行各种 HTRF 检测
通过专用、经验证的微孔板读板机模块提高 HTRF 检测灵敏度
通过专用的 HTRF 实验步骤，在 SoftMax® Pro 软件中进行快速简单的分析。

电子书： 从 ELISA 到 HTRF 表观遗传学

HTRF cAMP 检测，Gαi/o 偶联受体

环 AMP（cAMP，腺苷 3’, 5’-环单磷酸）是 GPCR 信号转导中的关键第二信使。cAMP 的产生可能是研究最多的信号转导通路，且涉及对感觉输入、激素、神经传递等的反应。配体结合 GPCR 后会发生构型改变，激活受体，转而激活 G 蛋白。G_αi/o 偶联受体的激活可抑制腺苷酸环化酶生成 cAMP。

探索我们的 G_αi/o 资源

应用说明： 在 SpectraMax M5e 读板机上进行 HTRF cAMP 动态 2 和 IP-One 检测
海报： 均相高通量活细胞 GPCR 功能性检测和表面结合检测

HTRF cAMP 检测，Gαs 偶联受体

环 AMP（cAMP，腺苷 3’, 5’-环单磷酸）是 GPCR 信号转导中的关键第二信使。cAMP 的产生可能是研究最多的信号转导通路，且涉及对感觉输入、激素、神经传递等的反应。配体结合 GPCR 后会发生构型改变，激活受体，转而激活 G 蛋白。进一步信号转导取决于激活的 G 蛋白的类型，但 G_αs 的激活会导致腺苷酸环化酶对 cAMP 的上调。

探索我们的 G_αs 资源

应用说明： 在 SpectraMax 多功能微孔板读板机上进行 HTRF cAMP HiRange 检测
应用说明： 通过 cAMP-G_s HiRange HTRF 检测对 GPCR 活性进行检测
海报： 均相高通量活细胞 GPCR 功能性检测和表面结合检测

HTRF 检测

Cisbio 的均相时间分辨荧光 (HTRF) 检测涵盖 G 蛋白偶联受体、激酶和细胞信号转导、表观遗传学以及生物标记物等领域。各种各样的试剂以及试剂盒均可应用于蛋白间相互作用、核受体检测、受体二聚化、配体结合、受体内化、酶检测等多个方面的研究。

HTRF 涉及使用两个荧光团（供体和受体）标记蛋白或其他目标生物分子。当生物分子相互作用时，它们的接近可使从供体到受体荧光团发生荧光共振能量转移 (FRET) 。使用生命周期较长的荧光镧系元素穴合物作为供体可以在 HTRF 检测中进行时间分辨检测，从而尽可能减少化合物和其他材料的短暂背景荧光。通过微孔板读板机检测时间分辨 FRET (TR-FRET) 可提供生物分子结合的读数。

海报： SpectraMax i3 多功能平台的 HTRF 技术

适用于均相时间分辨荧光 (HTRF) 的微孔板读板机

要获得理想的 HTRF 结果，需要经验证可满足 Cisbio 设定的 HTRF 性能规范的微孔板读板机。读板机的光学器件、能源、检测器以及用于检测 HTRF 的设置都会影响性能。我们的读板机使用优化的组件进行 HTRF 检测，包括适用于 SpectraMax i3x 和 Paradigm 多功能微孔板读板机的 HTRF 检测卡盒，以及适用于 SpectraMax iD5 读板机的强化时间分辨荧光 (TRF) 模块和经验证的滤光片。

Cisbio 的均相时间分辨荧光 (HTRF) 认证计划可确保带有“适用于 HTRF”徽标的读板机满足理想 HTRF 性能所需的规格。本技术说明介绍了经 Cisbio 验证的适用于 HTRF 的 Molecular Devices 微孔板读板机的优化设置。

应用说明： 适用于 SpectraMax 多功能微孔板读板机的优化 HTRF 设置
应用说明：SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机的 HTRF 分析服务

IP-One 检测，Gαq/11 偶联受体

磷脂酶 C (PLC) 是活化 G 蛋白的另一个常见靶标，对各种过程至关重要。例如，血小板中的凝血酶受体利用这一通路促进凝血。Cisbio IP-One 竞争性免疫检测可检测磷酸肌醇 (IP1) 的蓄积，这是一种稳定的 IP3 下游代谢物，由 G_αq/11 偶联受体激活后 PLC 的刺激诱导。该试剂盒允许直接表征黏附细胞和悬浮细胞中的受体激动剂和拮抗剂。

应用说明： 在 SpectraMax M5e 多功能微孔板读板机上进行 HTRF cAMP 动态 2 和 IP-One 检测

激酶和表观遗传学检测

蛋白激酶是在与细胞生长、代谢、分化和凋亡的控制有关的各种信号转导通路中起核心作用的酶。激酶是继 GPCR 之后第二重要的一组药物靶标。表观遗传学是对与核苷酸序列改变无关的可遗传表型变化（例如 DNA 甲基化和组蛋白修饰等改变）的研究。这些与各种疾病的发展有关，尤其是癌症。

探索我们的激酶和表观遗传学检测资源

测定氧化应激和糖酵解活性

细胞正常生存，需要三磷酸腺苷 (ATP) 形式的燃料来满足最基本的生物过程。这种燃料反应通过糖酵解和线粒体呼吸作用产生。尽管二者都能产生 ATP，但糖酵解在缺氧时仍然发挥作用，而线粒体则需要氧气才能进行氧化磷酸化 (OXPHOS) 的最后一步。了解这些通路对效应化合物的反应，可为了解细胞整体功能和决定细胞命运的潜在机制提供有用见解。

阅读我们的应用说明，以了解有关耗氧量和乙醇酸活性进展的实时数据采集和分析：