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TRF/TR-FRET (HTRF) 概述

时间分辨荧光 (TRF)

使用荧光素等传统荧光基团检测荧光强度 (FI) 时,荧光素的发射半衰期很短,大约只有数纳秒。样品的激发光和发射光的检测会同时进行。尽管微孔板读板机可以将发射光中的激发光筛选后有效去除,但这种激发光干扰、微孔板材质和待检测物质自发光等短半衰期光信号经常会干扰待检测荧光信号,导致高背景。

时间分辨荧光 (TRF) 通过使用铕或铽等能够发射长半衰期荧光信号的镧系元素作为荧光基团来降低背景信号值干扰。这种长半衰期荧光信号可持续数毫秒,因此可以使用脉冲光源(如氙闪灯)激发荧光基团,隔一段时间再进行发射信号检测(“计数窗”)。短半衰期荧光(仅持续数纳秒)在信号检测之前就会消失。使用时间分辨荧光进行检测可大大降低信噪比。最常使用的镧系元素是铕、铽和钐。这些镧系元素通常以螯合物或穴合物的形式应用以获得优质的信号强度和稳定性。

 

 

时间分辨荧光

时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET)

 

htrf-camp

非 FRET

供体和受体相隔很远

FRET

供体和受体相隔很近

TR-FRET结合了时间分辨荧光检测技术和荧光能量共振转移检测(FRET)技术。在FRET实验中,生物分子(如蛋白等)被荧光基团供受体标记。当生物分子之间相互作用,供受体荧光基团的距离被拉近。此时,若供体被激发,它会传递它的发射光能量给受体。受体和供体的发射光具有不同的波长,可以被微孔板读板机区分,从而定量生物分子之间的相互作用。

使用镧系元素荧光基团作为供体,发射光有很长的半衰期,TR-FRET可以利用时间分辨检测荧光,消除短半衰期背景荧光的干扰。在TR-FRET实验中,由于供体荧光基团发射光有较长半衰期,供受体荧光基团的激发和发射都可以在短半衰期背景荧光消失后再检测。

均相时间分辨荧光 (HTRF)

TR-FRET

HTRF是一种通用的TR-FRET技术,该技术由Cisbio发明,用于检测生物分子间的相互作用。典型的 HTRF 检测把铕穴状化合物用作供体,有机荧光团 d2 用作受体。供体和受体可以被用于标记各种生物分子,应用范围包括表观遗传学,生物标志物定量,GPCR信号转导等。HTRF 检测需要一个经 Cisbio 认证能兼容 HTRF 的带 TRF 检测模式的微孔板读板机。

客户研究的重大突破

iTeos 使用我们的多功能微孔板读板机(酶标仪)来确定针对肿瘤免疫微环境的疗法

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优势和注意事项

与传统荧光检测技术相比,TRF 和 TR-FRET 检测的主要优点包括降低背景和提高信噪比,因此可提高灵敏度。此外,该检测技术还有一种强大的混合-读数模式,无需进行任何清洗步骤。这一优点连同实验的稳定性,使该技术非常适用于自动化和小型化筛选类应用。

 

应用和检测

TRF 和 TR-FRET (HTRF) 检测可分析生物化学过程中的分子相互作用,被广泛用于研究激酶、细胞信号转导通路、蛋白相互作用、DNA 与蛋白的相互作用、细胞毒性以及受体与配体的结合。

TR-FRET 检测示例的概述见右表,几种时间分辨荧光资源见下文。
 

分析测定 供体 受体 波长
HTRF-Eu/红色* 铕穴状化合物 XL665 或 d2 Ex320 Em1 620/Em2665
HTRF-Tb/红色* 铽穴状化合物 XL665 或 d2 Ex340 Em1 620/Em2665
HTRF-Tb/绿色* 铽穴状化合物 荧光素或 GFP Ex340 Em1 620/Em2520
Lanthascreen Tb** 铽螯合物 荧光素 Ex340 Em1 490/Em2520
Lanthascreen EU** 铕螯合物 Alexa Fluor647 Ex320 Em1 620/Em2665
LANCE(原装)*** 铕螯合物 Surelight® APC Ex320 Em1 620/Em2665
LANCE Ultra*** 铕螯合物 ULight Ex320 Em1 620/Em2665

  • HTRF 检测

    HTRF 检测

    Cisbio 的均相时间分辨荧光 (HTRF) 检测涵盖 G 蛋白偶联受体、激酶和细胞信号转导、表观遗传学以及生物标记物等领域。各种各样的试剂以及试剂盒均可应用于蛋白间相互作用、核受体检测、受体二聚化、配体结合、受体内化、酶检测等多个方面的研究。

    HTRF 涉及使用两个荧光团(供体和受体)标记蛋白或其他目标生物分子。当生物分子相互作用时,它们的接近可使从供体到受体荧光团发生荧光共振能量转移 (FRET) 。使用生命周期较长的荧光镧系元素穴合物作为供体可以在 HTRF 检测中进行时间分辨检测,从而尽可能减少化合物和其他材料的短暂背景荧光。通过微孔板读板机检测时间分辨 FRET (TR-FRET) 可提供生物分子结合的读数。

    适用于均相时间分辨荧光 (HTRF) 的微孔板读板机

    适用于均相时间分辨荧光 (HTRF) 的微孔板读板机

    要获得理想的 HTRF 结果,需要经验证可满足 Cisbio 设定的 HTRF 性能规范的微孔板读板机。读板机的光学器件、能源、检测器以及用于检测 HTRF 的设置都会影响性能。我们的读板机使用优化的组件进行 HTRF 检测,包括适用于 SpectraMax i3xParadigm 多功能微孔板读板机的 HTRF 检测卡盒,以及适用于 SpectraMax iD5 读板机的强化时间分辨荧光 (TRF) 模块和经验证的滤光片。

    Cisbio 的均相时间分辨荧光 (HTRF) 认证计划可确保带有“适用于 HTRF”徽标的读板机满足理想 HTRF 性能所需的规格。本技术说明介绍了经 Cisbio 验证的适用于 HTRF 的 Molecular Devices 微孔板读板机的优化设置。

  • 利用HTRF技术检测人源 TNFα

    利用HTRF技术检测人源 TNFα

    人源TNFα 检测试剂盒可直接对 TNFα 进行定量检测。它使用一种夹心免疫测定方法,其中涉及两种特异性抗体:一种是用 Eu 穴状化合物标记的抗 TNFα,另一种是用 XL665 或 d2 标记的抗 TNFα。在有 TNFα 的情况下,这两种抗体都能结合 TNFα,使得两种标记相互靠近,从而发生 TRFRET(图 1)。信号与样品中抗原的浓度成比例。

    在本应用说明中,我们展示了 SpectraMax® Paradigm® 多功能微孔读板机(酶标仪)如何用优异的Z’因子进行强大的免洗细胞因子检测试验。

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    利用HTRF检测细胞因子,结合细胞活性综合评价

    利用HTRF检测细胞因子,结合细胞活性综合评价

    促炎性和抗炎性细胞因子在自身免疫性和炎症性以及传染性疾病方面发挥主要作用。它们还在代谢性疾病和肿瘤(尤其是在抗肿瘤免疫应答过程中)发挥关键作用。Cisbio Bioassays 的均相时间分辨荧光 (HTRF) 为各种细胞因子和趋化因子的定量提供了一个通用平台。

    本应用说明显示了如何使用带 SpectraMax® Minimax® 300 成像细胞计数器的 SpectraMax i3x® 多功能微孔板读板机来进行细胞因子分泌和细胞活性的相关分析。

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  • 测定氧化应激和糖酵解活性

    测定氧化应激和糖酵解活性

    为了存活,细胞需要三磷酸腺苷 (ATP) 形式的燃料来执行最基本的生物过程。这种燃料通过糖酵解和线粒体呼吸作用产生。尽管二者都能产生 ATP,但糖酵解在缺氧时仍然发挥作用,而线粒体则需要氧气才能进行氧化磷酸化 (OXPHOS) 的最后一步。

    本应用说明的优点:

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    HTRF cAMP dynamic 2 和 IP-One 检测

    HTRF cAMP dynamic 2 和 IP-One 检测

    此处用 cAMP dynamic 2 和 IP-One 两种不同的 HTRF 检测试剂盒展示了在 SpectraMax M5e微孔板读板机上HTRF的检测性能。G-蛋白偶联受体通过调节 cAMP 和增加 IP3 介导的细胞内钙水平这两个主要途径发挥作用。借助 cAMP dynamic 2 试剂盒,使用 Eu 穴状化合物标记的单克隆抗 cAMP 抗体和 d2 标记的 cAMP 可检测 cAMP 水平。IP-One 检测的形式与之相似,使用一种对 IP1 特异性的单克隆抗体,一种更稳定的 IP3 下游代谢物,有氯化锂存在的情况下,这种代谢物会在信号转导细胞中聚集。

    本应用说明描述了使用 cAMP dynamic 2 和 IP-One 试剂盒时生成的细胞检测数据和标准曲线。这些 HTRF 数据显示了使用 SpectraMax M5e 读板机时能获得的绝佳动态范围和 Z' 因子2。

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  • HTRF cAMP HiRange 检测

    HTRF cAMP HiRange 检测

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    HTRF cAMP HiRange 试剂盒可对细胞样品中的环磷酸腺苷(cAMP:环腺苷酸 3’, 5’-单磷酸盐)进行定量。cAMP 是 G-蛋白偶联受体 (GPCR) 信号转导中的一个关键第二信使。配体结合 GPCR 后会发生构型改变,激活受体,转而激活 G 蛋白。

    在本应用说明中,我们揭示了如何使用 SpectraMax® 多功能微孔板读板机来进行可靠的高通量 HTRF® 检测,并获得优良的 Z’ 因子和高度可重复的 EC50 值。

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    用于 Transcreener TR-FRET 检测的优化设置

    Transcreener TR-FRET 检测

    Transcreener® TR-FRET 检测属于单步骤竞争性免疫测定,可使用远红外时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 读数直接检测核苷酸。了解如何在 SpectraMax iD5 和 i3x 多功能微孔板读板机上优化用于 Transcreener TR-FRET 检测的设置。

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  • 从 ELISA 到 HTRF 表观遗传学

    从 ELISA 到 HTRF 表观遗传学

    使用优化的微孔板读板机设置和简化的分析克服 HTRF 检测挑战。

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时间分辨荧光 (TRF) / TR-FRET (HTRF) 资源

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