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荧光偏振 (FP)

荧光偏振 (FP)

 

荧光偏振 (FP) 是一项广泛用于监测不断变化的结合事件的技术。其可用于评估包括蛋白-抗体结合和 DNA 杂交在内的生物分子相互作用以及酶活性,适用于基础研究以及高通量筛选。

通过平面偏振光激发的荧光标记小分子(示踪剂)可发射消偏振程度最高的光,这是因为示踪剂在激发与发射之间的间隔时间里快速减少。但当示踪剂结合一个比之大得多的分子时,它的旋转速度就会变慢,同时发射光仍然有大部分产生偏振。

 

 

荧光偏振 G 因子

 

偏振以 milli P 或 mP 为单位表示,其使用检测到的相对于偏振激发光方向的垂直 (Iperp) 和平行 (Ipara) 荧光强度测量值进行计算(参见下文的公式)。使用 G 因子 (G) 校正滤光片、偏振片和单色器等光学元件的影响,其中这些元件会影响偏振值。

 

公式

未结合的示踪剂

结合更大分子的示踪剂

荧光标记的分子或与示踪剂结合的分子越大,mP 值就越大。

荧光偏振 G 因子

荧光偏振相比其他结合检测的优势

 

荧光偏振可以用来研究受体-配体相互作用、蛋白-DNA 相互作用、蛋白水解、膜流动性、酶测定等。荧光偏振检测已成功用于研究众多靶点,包括激酶、磷酸酶、蛋白酶、G 蛋白偶联受体 (GPCR) 和核受体。

以下优势使得荧光偏振检测特别适用于高通量筛选:

  • 均相(无需清洗步骤)
  • 非放射性
  • 比率式(单波长)
  • 微型化

在 SpectraMax 多功能微孔板读板机(酶标仪)上进行 IMAP 磷酸二酯酶测定

 

Molecular Devices 的 IMAP® 技术可以对激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶进行快速、均相、非放射性测定,而且适用于检测开发和高通量筛选。IMAP 检测基于磷酸盐与纳米粒上固定金属配合物的结合。IMAP 结合实体与磷酸化底物结合时,肽的分子运动会被改变,附着于肽的荧光标记的荧光偏振 (FP) 会增加(图 1,左图)。在时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 实验中,有磷酸化底物时,使用铽 (Tb) 供体会引起荧光能量转移(图 1,右图)。这项实验在时间分辨模式下进行检测,几乎消除了来自实验组分或筛选化合物的荧光干扰。TR-FRET 还能灵活改变底物大小和浓度。

环核苷酸磷酸二酯酶 (PDE) 是一组可降解 cAMP 和 cGMP 磷酸二酯键的酶,其中 cAMP 和 cGMP 是参与各种生物过程的第二信使。它们在心脏病、痴呆症、抑郁症等领域具有临床意义,是一类关键的可用药靶标。在此处,我们展示了如何使用 SpectraMax® 多功能微孔板读板机SoftMax® Pro 软件并采用 IMAP 技术来测定 PDE 酶稀释和抑制曲线。

 

IMAP 偏振和 TR-FRET 磷酸二酯酶实验原则

 

图 1:使用荧光标记的底物进行磷酸二酯酶反应。随后添加包含较大M(III)基底纳米粒的结合溶液。在荧光偏振读数(左图)中,较小的磷酸化荧光底物结合较大的纳米粒会降低底物的旋转速度,并增加其荧光偏振。在 TR-FRET 读数(右图)中,磷酸化底物和铽供体均结合纳米粒,从而使铽供体靠近底物上的荧光素受体并实现荧光共振能量转移。

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简化在细胞株开发中测定 IgG 的工作流程

 

在单克隆抗体开发和生产的许多阶段,测定 IgG 的产生是关键步骤。常用的 IgG 定量测定方法要么需要特殊仪器和娴熟人员,例如高效液相色谱法 (HPLC) 和表面干扰量度法,要么需要耗时的测定法,例如酶联免疫吸附检测 (ELISA)。尽管 ELISA 是一种被广泛认可的蛋白定量方法,但它操作过程时间长,步骤多。此处,我们介绍了在抗体开发和生产过程中通过 Valitacell 的 Valita®TITER 实验来测定 IgG效价的方法。

基于荧光偏振(FP)技术ValitaTITER 实验可以用来检测 IgG Fc 与蛋白 G 的相互作用。96 孔微量滴定板的每个孔都涂有荧光标记的 IgG 结合肽蛋白 G。向孔中添加样本时,蛋白 G 分子重悬并与之发生结合。蛋白 G 结合抗体时,其分子运动的速度下降,从而导致荧光偏振值升高(图 2)。

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使用荧光偏振技术的 ValitaTITER 实验原则

图 2:在缓冲溶液中,游离蛋白 G 分子更小且旋转速度更快。因此,偏振激发光会发生失偏振(顶图)。当蛋白 G 分子结合样本中的抗体时,这种增大复合体的旋转速度就会下降,从而导致荧光偏振值升高(底图)。

  • 建立并优化荧光偏振检测

    建立并优化荧光偏振检测

    本技术说明旨在提供信息来帮助用户确定最佳的实验条件,从而把现有的实验转化成可靠的荧光偏振实验。示例是常用于评估受体-配体结合的一种竞争性结合实验类型。假设熟悉荧光偏振的基本原则。

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    IMAP 荧光偏振激酶检测

    IMAP 荧光偏振激酶检测

    蛋白激酶对很多细胞进程的调控非常重要。近年来,它们已成为癌症及许多其他疾病最重要的药物靶标类别之一。Molecular Devices 的 IMAP® 技术可以对各种激酶进行快速、非放射性测定,而且适用于检测开发和高通量筛选。

  • IMAP 磷酸二酯酶检测

    IMAP 磷酸二酯酶检测

    IMAP 技术可为激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶筛选提供一个均相、不基于抗体的平台。它稳定可靠,可产生高质量数据和优良 Z’ 因子值,具有微型化特点,因此适用于抑制剂筛选。不同于一些其他的方法,IMAP 可测定直接结合情况,从而获得更贴切的结果。IMAP TR-FRET 实验还能直接进行 Km 测定。

    IMAP 技术

    IMAP 技术

    迄今为止,我们已使用放射性同位素或高特异性抗体测定了激酶活性。针对这个问题,Molecular Devices 采用其专有的 IMAP® 技术,提供一种适用于各种激酶的非放射性、均相测定,而无需考虑底物肽序列的检测方法。这种测定是一个简单的“混合后读取”过程,可以准确测定酶活性。

  • Transcreener ADP2 检测

    Transcreener ADP2 检测

    Transcreener® ADP2 测定属于均相测定,其荧光读数可用来检测和筛选已确定的药物靶标(包括蛋白和脂质激酶)以及新发现的靶标(例如碳水化合物激酶、三磷酸酶、热休克蛋白和其他三磷酸腺苷酶)。这种测定基于 ADP 免疫检测。提供三种检测模式来满足用户的检测需求:荧光偏振 (FP)、时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 和荧光强度 (FI)。

    ValitaTITER 实验

    ValitaTITER 实验

    ValitaTITER 实验是一种均相、高通量方法,可在细胞系开发工作流程中精确快速定量 IgG。这种 96 孔测定法已在 SpectraMax iD5 读板机和 Molecular Devices 的其他读板机上通过荧光偏振检测试验充分进行了验证,以确保结果可靠。SoftMax Pro 软件能自动进行标准曲线拟合和样本定量,最大程度减少检测的设置时间。

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视频和网络研讨会

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