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Transfluor 测定

利用高内涵筛选系统, 检测作用于已知和/或GPCR孤儿靶点的化合物活性

Transfluor® 测定是一种基于细胞的荧光测定, 可用于筛选 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 的配体以及通过失活或脱敏共同通路调节 GPCR 的其他潜在药物。通过将荧光标记连接到 β-arrestin, 可以在受体激活期间监测受体-arrestin蛋白复合物的位置。由于脱敏仅发生在激活的受体中, 因此可通过监测 β-arrestin 转位和随后的受体再循环来检测任何 GPCR 的激活。

研究这种机制使研究人员能够确定 GPCR 配体对各种生理过程(包括行为、情绪、炎症神经系统和嗅觉反应等)的影响。此外, 研究人员可以了解受体降解和特定靶点再循环的复杂性。

特点

  • 使用 100 多种 GPCR 进行验证, 结果表明 Transfluor 测定法可检测所有 GPCR 种类(I、II、III), 而无需顾及相互作用的 G 蛋白(Gs、Gi/o 和 Gq/11)。
  • 单次读取功能支持所有 GPCR 亚型, 包括 Gi、Gs、Go、Gq, 而无需对多个 GPCR 分别检测
  • 无需对 GPCR 进行标记, 避免了自行改变分子结构可能会造成的的靶点反应改变。
  • 方法通用, 无需预先了解相互作用的 G 蛋白即可实现孤儿 GPCR 筛选。
  • 基于 GFP 的技术, 无需加入额外的底物来监测 β-arrestin 转位。
  • MetaXpress® 应用模块可自动分析 β-arrestin 向细胞膜(小窝)和内吞囊泡的运动。
  • 不依赖配体的转位 (LITe™) 测定是一种不依赖激动剂的测定, 可用于验证孤儿 GPCR 中的 β-arrestin-GFP 的转位。

采用 Transfluor 技术, arrestin-GFP 可分散在未受刺激细胞的整个胞液中。当配体与 GPCR 结合时, arrestin-GFP 可快速从胞液转位到细胞膜, 随后进入到细胞膜上网格蛋白包被的小窝中。然后, 受体在经过再处理之前内化入内吞囊泡并返回细胞膜。可以通过市售的图像分析仪器, 例如 ImageXpress® MicroImageXpress® Ultra 系统, 对小窝和囊泡进行成像和定量, 由此奠定了面向所有 GPCR(已知和孤儿)的通用、高通量、高内涵测定的基础。

 

孤儿 GPCR 测定

 

与目前筛选 GPCR 的方法相反, Transfluor 技术的创建基础是终止 GPCR 信号传导的机制, 称为受体失敏。这种机制几乎是所有 GPCR 所共享的, 且其通过配体结合而激活。Transfluor 技术不需要预先了解相互作用的 G 蛋白。Transfluor 技术的这一重要特性使其成为筛选孤儿 GPCR (oGPCR) 的理想选择。

协助验证孤儿 GPCR 筛选的专有技术称为 LITe™(不依赖配体的转位), 是一种不依赖激动剂的测定方法, 可用于验证孤儿 GPCR 中 ß arrestin-GFP 的转位。

不依赖配体的转位

 

Transfluor 参考文献

 

Garippa RJ, Hoffman AF, Gradl G, Kirsch A.
High-throughput confocal microscopy for beta-arrestin-green fluorescent protein translocation G protein-coupled receptor assays using the Evotec Opera.
Methods Enzymol.2006;414:99-120.

Hudson CC, Oakley RH, Sjaastad MD, Loomis CR.
High-content screening of known G protein-coupled receptors by arrestin translocation.
Methods Enzymol.2006;414:63-78.

Oakley RH, Hudson CC, Sjaastad MD, Loomis CR.
The ligand-independent translocation assay:an enabling technology for screening orphan G protein-coupled receptors by arrestin recruitment.
Methods Enzymol.2006;414:50-63.

Haasen D, Wolff M, Valler MJ, Heilker R.
Comparison of G-protein coupled receptor desensitization-related beta-arrestin redistribution using confocal and non-confocal imaging.
Comb Chem High Throughput Screen.2006 Jan;9(1):37-47.

Ghosh RN, DeBiasio R, Hudson CC, Ramer ER, Cowan CL, Oakley RH.
Quantitative cell-based high-content screening for vasopressin receptor agonists using transfluor technology.
J Biomol Screen.2005 Aug;10(5):476-84.

Ozawa K, Hudson CC, Wille KR, Karaki S, Oakley RH.
Development and validation of algorithms for measuring G-protein coupled receptor activation in cells using the LSC-based imaging cytometer platform.
Cytometry A. 2005 May;65(1):69-76.

Oakley RH, Hudson CC, Cruickshank RD, Meyers DM, Payne RE Jr, Rhem SM, Loomis CR.
The cellular distribution of fluorescently labeled arrestins provides a robust, sensitive, and universal assay for screening G protein-coupled receptors.
Assay Drug Dev Technol.2002 Nov;1(1 Pt 1):21-30.

这种获得杜克大学许可的专利技术使用转基因细胞系来表达标记的 β-arrestin 和标注的 GPCR, 并且可以用于筛选天然或合成配体, 包括激动剂或拮抗剂。Transfluor 测定不需要预先了解相互作用的 G 蛋白, 使其非常适合于筛选孤儿 GPCR (oGPCR)。

使用 ImageXpress 成像的 Transfluor 测定

用 Discovery-1 成像的 Transfluor 测定
图 1. 用异丙肾上腺素刺激并表达 ß2AR 的细胞。左侧:对照, 中间:小窝, 右侧:囊泡。顶部:使用 ImageXpress 成像的 Transfluor 测定。底部:用 Discovery-1 成像的 Transfluor 测定。

 

异丙肾上腺素小窝

异丙肾上腺素囊泡
图 2:采用 MetaXpress 的 GPCR 循环应用模块进行的分割和分析。对异丙肾上腺素的剂量效应。顶部:小窝, 底部:囊泡。误差条显示标准误差。

 

部分 GPCR 列表

 

Transfluor 技术主要通过检测细胞中 β-arrestin-GFP 的活动来监测受体活性。已显示转位 β-arrestin-GFP 的 GPCR 部分列表如下所示。

Gs

Gi/o

Gq/11

  • A2a 腺苷
  • A2b 腺苷
  • β1-肾上腺素能
  • β2-肾上腺素能
  • CRF1 促肾上腺皮质激素释放因子
  • D1 多巴胺
  • D5 多巴胺
  • FSH 促卵泡激素
  • 胰高血糖素
  • LH 黄体化激素
  • PTH1 甲状旁腺激素
  • E2 前列腺素
  • E4 前列腺素
  • 分泌素
  • VIP1 血管活性肠肽
  • V2 血管加压素
  • α2a-肾上腺素能
  • α2b-肾上腺素能
  • α2c-肾上腺素能
  • A1 腺苷
  • A3 腺苷
  • Apelin
  • C5a 过敏毒素
  • CCR5 趋化因子
  • CXCR1 趋化因子
  • CXCR2 趋化因子
  • CXCR4 趋化因子
  • D2 多巴胺
  • D3 多巴胺
  • D4 多巴胺
  • Edg1 内皮细胞分化基因
  • Edg2 内皮细胞分化基因
  • Edg3 内皮细胞分化基因
  • Edg5 内皮细胞分化基因
  • 5HT1A 羟基色胺
  • δ-阿片样物质
  • mμ-阿片样物质
  • MCH1 黑色素聚集激素
  • M2Ach 毒蕈碱乙酰胆碱
  • E3 前列腺素
  • N-甲酰肽
  • 神经肽 FF
  • 生长抑素
  • α1b-肾上腺素能
  • AT1A 血管紧张素 II
  • CCK-A 胆囊收缩素
  • CCK-B 胆囊收缩素
  • 巨细胞病毒 US28
  • ETA 内皮素
  • GnRH(2 型)促性腺激素释放激素
  • 5HT2A 羟基色胺
  • 5HT2C 羟基色胺
  • m1Ach 毒蕈碱乙酰胆碱
  • mGluR1 代谢型谷氨酸
  • NK1 神经激肽
  • NK3 神经激肽
  • NT1 神经降压素
  • 食欲肽-1
  • 催产素
  • PAR2 蛋白酶激活
  • 血小板活化因子
  • TRHR-1 促甲状腺激素释放激素
  • TRHR-2 促甲状腺激素释放激素

其他受体列表

  • 12果蝇 GPCR
  • Fz4 卷曲蛋白受体
  • TßRIII 转化生长因子-ß

Transfluor 测定可与以下系统兼容:

有关更多信息, 请参阅检测试剂盒和仪器的兼容性表

购买这些 Transfluor 产品需要事先签署 Transfluor 许可证协议和 BioImage 许可证。如果订购 GFP 细胞系或质粒, 还需要购买 Prolume 许可证。

产品名称 货号

Transfluor® 评估试剂盒(非商业用途)
R8177

Transfluor® 评估试剂盒(商业用途)
R8178
U2OS (G418) 大鼠 b-arrestin 2-RrGFP 亲本细胞系 TF-U2OS-rBA2GFP

 

Transfluor 评估试剂盒

 

Transfluor 评估试剂盒允许在有限的六个月评估期内一次性使用该技术。该试剂盒可为用户采用自己的仪器和 GPCR 评估技术提供所需的所有必要工具。这使得用户可以先对该技术进行熟悉了解, 然后再考虑获取能满足其特定需求的分层许可选项。

 

Transfluor 评估试剂盒组件

 

  • U-2 OS β-arrestin 2-GFP 细胞(亲代细胞系, 以帮助检测 Transfluor 实验方法)
  • Transfluor 演示板(具有固定细胞的成像级板, 以辅助仪器验证以及图像采集和分析)
  • 受限的标签许可证
  • Transfluor 评估试剂盒产品插页
  • U-2 OS β-arrestin 2-GFP 细胞产品插页
  • Transfluor 快速启动方案

Transfluor 用户指南(完整协议和故障排除指南)

有关此试剂盒的详细信息, 请与当地销售代表联系。

分层许可选项

使用 Transfluor 技术需要购买 Molecular Devices 的 Transfluor 技术使用许可证, 该许可证可以每年续订。可扩展的许可证结构(从研究至高通量筛选), 包括以下示例:

  • Transfluor 测定研究定点许可证
  • Transfluor 测定研究全球许可证
  • Transfluor 筛选定点许可证
  • Transfluor 测定研究和筛选定点许可证

运行 Transfluor 测定还需要两个额外的第三方许可证:GFP 许可证(Molecular Devices 推荐 Prolume 海肾荧光素酶 (Rr) GFP 许可证)和 BioImage 的荧光再分发许可证。条款如下:

  • Prolume 许可证可以每年续订, 仅象征性地收取少量费用。
  • BioImage 许可证是一次性收费。
  • Prolume 和 BioImage 许可证均可提供全球范围内的许可。

为简化您的流程, 您可以直接从 Molecular Devices 公司获取这些许可证。或者, 您也可以直接从 Prolume 和 BioImage 获取。

有关这些许可证的详细信息, 请与当地销售代表联系。结合 Transfluor 许可证, Molecular Devices 还提供稳定转染的 GFP β-arrestin 启动子细胞系和相关质粒。