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单克隆性

记录单克隆性——治疗性细胞系的监管指标

什么是单克隆性?

单克隆性是描述起源于单个祖细胞(单细胞),并因此属于单克隆的细胞系的术语。细胞株开发和单克隆性验证是生产生物制药分子(如单克隆抗体)的过程中的关键步骤。在分离稳定表达目标蛋白的单个活细胞后,可建立细胞株。此过程中的一个关键结点是记录克隆性证据,以确保细胞系的遗传可重复性。

单克隆性的记录(治疗性细胞系的监管指标)通常都是图像形式的,据此可记录单细胞的图像并将其纳入监管文件中。

单克隆性验证——查看集落起源

单克隆性验证:查看克隆起源。每个孔的生长(图像)历史可追溯到其起点:提供单克隆性的证据

单克隆性为什么很重要?

随着细胞株开发法规日益严格,研究人员将需要进行单细胞克隆并提供细胞系源于某个单细胞的证据:克隆性证据。传统克隆方法(如有限稀释和荧光激活细胞分选法 (FACS))使用统计分析来确定单克隆性的置信度。然而,单克隆性的记录需要更为可靠的生物处理技术和方法。现在,许多科学家通常使用成像系统(如 CloneSelect Imager成像仪)来验证单克隆性和监测细胞培养基中的细胞生长。此外。

细胞株开发需要较高的单克隆性确证度

开发表达特定目的蛋白的细胞株对于生物制品的产生而言至关重要,并且监管机构要求需具备单克隆性的证据才能将生物产品投入市场。传统方法包括在第 0 天使用透射白光观察微孔,以确认单细胞的存在。但是,这种方法不无挑战,因为细胞碎片和微孔伪影很容易被误认为细胞。因此,细胞株开发人员通常对克隆状态下的细胞进行评估,并追溯克隆的起源以确认单克隆性。

该工作流程着重于使用 CloneSelect Imager成像系统根据目标图像分析来验证单克隆性的过程。与用于进行单细胞分选的 CloneSelect 单细胞分离系统结合使用,可提高克隆成活率和基于图像的单克隆性确证度,从而改善该工作流程。

单克隆性工作流程
单克隆性工作流程
  1. 将单细胞分选进微孔板孔中 – 必须分离并克隆单个活细胞以确保细胞群的基因相同,从而显著降低表达的异质性。

  2. 在第 0 天和其后几天扫描平板 WL – 在第 0 天和其后几天对平板进行成像。单克隆性的记录(治疗细胞株的一个监管指标)通常都是图像形式的,据此可记录单细胞的图像并将其纳入监管文件中。

  3. 查看平板扫描结果并评估总体增生 (WL) 情况 – 查看并分析追踪细胞生长速率、汇合度测定和克隆形成的图像。

  4. 确认单克隆性并导出微孔数据以供出于监管目的进行提交 – 确认单克隆性并导出详细微孔数据以供出于监管目的进行提交

使用单细胞分离系统提高克隆成活率

CloneSelect 单细胞分离系统系列是一个全自动系统,它采用专有微流控技术和实时图像分析,分选出单细胞并接种到标准微孔板中,同时通过图像记录提供单克隆性确证度。它通过提供图像形式的克隆性证据、基于白光(c. sight 和 f. sight 系统)或可选荧光(仅 f. sight 系统)的迅速高效单细胞接种、出色的接种后细胞生长、更低程度的交叉污染风险,以及极低的维护成本来解决基于有限稀释和流式细胞术的细胞分选的缺点。与 CloneSelect Imager成像仪结合使用时,单细胞分离系统系列表现出对这两种工作流程的改进,即提高了克隆成活率和基于图像的单克隆性确证度。

使用单细胞分离系统提高克隆成活率

CloneSelect 单细胞分离系统技术 (A) 在将含细胞的样本上样至分离槽中后,将分离槽安装到单细胞分离系统 (SCP) 上,然后可开始单细胞分离。在分离过程中,
压电致动器会以可预测的顺序连续产生液滴,直接通过真空机械装置在喷嘴下方虹吸去除不含细胞或含不止一个细胞的液滴。
识别出单细胞事件时,机械关闭装置会阻断真空状态,使含单细胞的液滴落入微孔中。(B) 检测到单细胞事件时,将在喷嘴处捕获 5 张图像以提供克隆性证据。
图像 -3 显示在液滴喷出前存在一个细胞,图像 4 标记出含单细胞的区域,而图像 5 显示液滴喷出后的喷嘴。

微孔板成像、克隆表征和报告生成 微孔板成像、克隆表征和报告生成

(A) 对源自单细胞分离的第 10 天克隆进行成像。可通过“平板略缩图”选项卡查看克隆。点击各微孔即可为用户导航至“查看图像”选项卡,其中将显示全孔图像。(B) “Loci Count”选项卡允许通过调整克隆大小和紧密度(一个圆度指标)来优化克隆计数。(C) 在“生成报告”选项卡中,可为一个系列中的各时间点指定和调整细胞区域(绿色框),以表征从单细胞变为克隆的生长。

什么是单克隆,什么不是单克隆

通过使用 CloneSelect Imager成像仪软件来放大各个固定克隆,可以查看不同时间点的克隆图像,从而追踪生长并确定一个克隆是否为单克隆。下图显示了两个克隆的图像。通过观察两个克隆的生长并追溯直至第 0 天的图像,可确定克隆是否起源于一个或多个细胞。向半固体培养基添加微珠(如黄色圈所示)即可作为位置对照,以确认每次成像的都是同一克隆。

单克隆单细胞集落

中国仓鼠卵巢悬浮 (CHO-S) 细胞在 CloneMedia CHO Growth A 半固体培养基中的生长使用 CloneSelect Imager 成像仪在不同时间点捕获 6 孔板中的图像。在第 0 天时,顶排明显观察到存在一个细胞,而底排观察到两个细胞。黄色圈显示作为位置对照以确认随时间成像的是同一克隆的微珠的位置。

提供单克隆性图像证据(报告)

在细胞株开发过程中提供单克隆性的图像证明并不像导出单细胞图像一样简单。例如,还应检查全孔高分辨率图像以确保不存在第二个细胞。

仅需几次点击,CloneSelect™ Imager成像仪 (CSI) 上的“单克隆性报告”功能即可客观地将证实克隆性所需的支持性图像证据整理到可轻松共享的报告中,从而为研究人员节省人工执行相同过程所需的时间。

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单克隆性验证

单克隆性确证方法

了解更多有关用于验证和记录单克隆性的不同方法的信息

  • 使用钙黄绿素 AM 来确证克隆性

    使用钙黄绿素 AM 来确证克隆性

    使用对活性影响小的 Calcein AM 来确证单克隆性

    在此,我们展示了一个优化的工作流程,其中将荧光试剂(钙黄绿素 AM)和显示出与无标记状态相似的活性,同时还能提供较高的克隆性确证度,并且具有荧光功能的 CloneSelect™ Imager成像仪结合使用。

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    电子书:优化您的优质细胞株

    优化您的优质细胞株

    在该电子书中,我们提供了细胞株开发工作流程以及高通量解决方案(用于加快流程并实现高产哺乳动物细胞株的轻松快速选择)的概述。

    下载电子书  

  • 用于识别单克隆 CHO-S 细胞的荧光方法

    用于识别单克隆 CHO-S 细胞的荧光方法

    促进细胞株开发的快速单克隆验证方法

    尽管可以通过白光成像来验证单克隆性,但碎片、灰尘和气泡使识别单细胞变得困难且耗时,这可能导致高价值克隆丢失。在此,我们提出一种使用 CellTracker Green来识别单克隆 CHO-S 细胞的荧光方法。

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    细胞株开发需要较高的单克隆性确证度

    细胞株开发需要较高的单克隆性确证度

    通常进行有限稀释或荧光激活细胞分选以将单细胞接种到微孔中。随后使用显微镜确定每个微孔中接种的细胞数并监测细胞生长。尽管可以通过白光成像来验证单克隆性,但碎片、灰尘和气泡使识别单细胞变得困难且耗时,这可能导致高价值克隆丢失

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  • 识别半固体培养基中生长的单克隆 CHO-S 细胞

    识别半固体培养基中生长的单克隆 CHO-S 细胞

    可靠识别半固体培养基中生长的单克隆 CHO-S 细胞

    相比在液体培养基中进行有限稀释,在 CloneMedia CHO Growth A 中培养 CHO 细胞是一种更加有效的 CHO 细胞克隆方法。半固体培养基可固定细胞,从而防止细胞在常规处理过程中移动。这使得研究人员能够更可靠追踪单个细胞生长成一个克隆的情况。

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    通过更高的克隆性确证度来提高克隆效率

    通过更高的克隆性确证度来提高克隆效率

    结合单细胞分离与微孔板成像的工作流程提高了克隆效率和单克隆性确证度

    优化的工作流程可通过提高增长效率来节省时间、精力,并降低消耗品和试剂成本,同时提供较高的克隆确证度和迅速记录,且记录文件可即时提交给监管机构。

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  • 单克隆性报告

    CloneSelect 成像仪单克隆性报告功能

    CloneSelect Imager成像仪单克隆性报告功能

    仅需几次点击,CloneSelect Imager 成像仪上的“单克隆性报告”功能即可客观地将证实克隆性所需的支持性图像证据整理到可轻松共享的报告中,从而为研究人员节省人工执行相同过程所需的时间。

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    简化哺乳动物细胞系的筛选和选择

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    使用 ClonePix 系统评估单克隆性

    ClonePix 系统是一项强大的工具,可对通常用于生产治疗性蛋白和研究单克隆抗体的分泌型哺乳动物细胞系进行快速筛选和分离。本教程中列出的数据支持从半固体培养基中挑选哺乳动物细胞克隆是分离克隆细胞系的有效手段。

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