什么是基因编辑?
基因编辑是一种可删除、插入、替换或改变活体基因组 DNA 的基因操作。基因编辑具有位点特异性靶向性,可通过各种技术使 DNA 断裂,但并不一定涉及修复机制。它包括两种技术,即失活和矫正。
失活是指靶基因转变,矫正可通过基因断裂促进缺陷基因的修复。基因编辑在无数领域中拥有巨大潜力,包括药物开发、基因手术、动物模型、疾病研究和治疗、食物、生物燃料、生物材料合成等。
虽然 CRISPR 是一种近年来广泛应用的主要基因编辑技术,但人们对基因编辑的研究始于 20 世纪后期。自从 CRISPR 这个原本雄心勃勃的应用问世以来,基因治疗已成为基因编辑中备受欢迎的应用。可以通过基因添加和基因编辑两种方法实现,其中基因添加可在现有遗传物质上进行添加以弥补有缺陷或缺失的基因,而基因编辑则可通过直接修改疾病相关的 DNA 来治疗疾病。

CRISPR/Cas9 机制。通过先结合导向 RNA,再结合紧挨在 3-核苷酸 PAM 序列之前的匹配基因组序列来激活 Cas9 酶。然后,Cas9 酶会引起双链断裂,并通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向重组 (HDR) 途径修复 DNA,从而形成编辑后的基因序列。
设计一种与 crRNA 相似的导向 RNA (gRNA) 来靶向基因中的某个区域,Cas9 酶可以在宿主细胞基因组的这个特定区域中引起双链断裂(图 1)。双链断裂发生后,细胞将采用两种修复途径中的一种:非同源末端连接 (NHEJ) 途径或同源定向重组 (HDR) 途径。NHEJ 途径常用于通过碱基插入或删除 (indels) 来扰乱基因,而 HDR 途径可用于通过在两个相似或相同的 DNA 分子之间交换序列来敲入报告基因或编辑序列。
通过 CRISPR 改造扩大基因编辑规模
“CRISPR” – 成簇规律间隔短回文重复序列。这些 DNA 序列最初被发现是细菌和古生菌等原核生物免疫系统的一部分,并自 2012 年以来成为重要的基因编辑工具(Jinek 等人,2012 年)。它在无数应用中拥有广阔的前景,包括农业、疾病建模、基因治疗和药物发现等等。它的准确性使之成为 DNA 序列插入(敲入)、删除(敲除)和其他修改的理想工具。它已在很大程度上取代了 TALENS 和 ZFNS 等繁琐且昂贵的现有基因编辑工具。
CRISPR 序列包含既往病毒入侵者的 DNA(称为各回文重复序列后的间隔区),这些序列有助于检测和破坏未来相似的病毒。了解这一机制(Jinek 等人,2012 年)后,在真核细胞中首次使用了 CRISPR(Cong, L 等人,2013 年),随后在其他细胞类型和不同领域的生物体中使用。CRISPR – Cas9 系统有两种主要成分,可形成核糖核蛋白复合物。第一种成分或导向 RNA 会结合基因组中的互补 DNA 序列,第二种成分,即源自酿脓链球菌的 Cas9 (SpCas9),会在目标位点处引起双链断裂。前间区序列邻近基序 (PAM) 是最初结合核酸酶并发生上游切割的位置。不同的 CRISPR 核酸酶具有不同的 PAM 位点,切割发生后,细胞修复系统被激活并且对基因组的编辑也会启动。
基因编辑工作流程
采用 CRISPR 机制以获得确认编辑细胞系的基因编辑工作流程有多个步骤。使用合适的工具对这些步骤进行有效优化,有助于有效减少取得各种科学进展所需的时间、精力和成本。这种方法有助于加快研发,并彻底改变药物发现、疾病治疗、基因编辑的剪切生产等。我们对涉及的步骤和所提供的有效解决方案进行讨论,以支持全球科学界通过基因编辑将他们的努力付诸实践。
验证 CRISPR/Cas9 基因编辑的研究解决方案
Molecular Devices 的仪器系列可有效用于执行/筛选实验,从而确保基因编辑工作取得成功。全新的 CloneSelect Imager Florescence (CSI-FL) 可在获取单细胞打印、转染效率、细胞融汇和多通道荧光筛选数据后保证第 0 天的单克隆性,以便在更短的跟踪时间内和较低的过传代风险下采用机器人技术来验证基因编辑的有效性。
此外,我们的 SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机可用于评估转染效率、监测细胞生长、定量测定 DNA 和蛋白,并通过 ScanLater 蛋白印迹分析验证 CRISPR/Cas9 编辑。使用 ImageXpress 显微共聚焦系统可以获得高品质的自噬体图像,同时 MetaXpress HCI 软件可识别和定量测定每个细胞中的单个自噬体,从而使我们能够分析 CRISPR/Cas9 基因编辑中发生的表型变化。
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加快基因编辑细胞系开发
了解全新的 CloneSelect® Imager FL 如何帮助轻松检测成功转染的细胞,缩短细胞系开发时间以及更快扩大您的研究规模。在早期阶段废弃低转染效率池,使用多通道荧光检测来确认和跟踪各种 CRISPR 编辑,使用机器人重设计准确且自信地筛选细胞,同时降低过传代干扰的风险。
克隆产量筛选和滴度
识别优质克隆的一个重要步骤是测定单细胞来源克隆的表达量。使用传统方法筛选产率费力且耗时,通常包含多个步骤,涉及从有限稀释中分离单细胞之后再用 ELISA 进行滴度评估。ClonePix 2 系统将表型选择、单细胞分离和产率筛选合为一个步骤,因此可明显缩短筛选时间并增加候选物数量。
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使用钙黄绿素 AM 来确证克隆性
使用对活性影响小的 Calcein AM 来确证单克隆性
在此,我们展示了一个优化的工作流程,其中将荧光试剂(钙黄绿素 AM)和显示出与无标记状态相似的活性,同时还能提供较高的克隆性确证度,并且具有荧光功能的 CloneSelect™ Imager 成像仪结合使用。
细胞系开发中的规律间隔成簇短回文重复序列 (CRISPR)
靶向基因编辑(尤其是 CRISPR)已使科学发生了彻底变革,并在各种领域中应用广泛,主要包括细胞系开发、细胞和基因疗法。
典型的细胞系开发需要筛选成千上万的克隆,以找到能生成大量生物制品的最佳稳定细胞。在本应用说明中,我们讨论了哺乳动物细胞系开发工作流程的自动化 — 用于编辑、单克隆性和生长评估的转染细胞的自动化、集成筛选。
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CRISPR/Cas9 基因组编辑实验
CRISPR/Cas9 基因编辑系统是一个用来研究基因功能的非常受欢迎的工具,因为它相对容易使用且准确。此外,该系统还在治疗遗传性疾病方面具有巨大的潜力。为了确保目标基因被成功敲减或敲除,必须对 CRISPR/Cas9 基因编辑进行验证。在这里,我们通过使用 CRISPR/Cas9 敲减 HEK293 细胞中的自噬相关蛋白 5 (ATG5) 来演示 Molecular Devices 的仪器系列如何用于基因编辑实验。
药物发现和开发
药物发现形势在不断变化,更多的科学家开始专注于细胞系开发、疾病模型和围绕生理相关 3D 细胞模型的高通量筛选方法。原因显而易见:在研究中使用可高度模拟患者疾病状态或人体器官的细胞模型系统,能够更快地将挽救生命的治疗推向市场。
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单细胞分选
细胞株开发就是发现源自单个细胞的克隆,其可稳定高表达目标治疗性蛋白。此过程的第一步是分离活的单细胞。有限稀释是一种依赖于统计概率的技术,但很耗时。DispenCell™ 单细胞分配器能够快速、简单且轻柔地分离细胞,并提供细胞分配后克隆性和可追溯性的即时证明。
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转染效率
荧光报告基因的转染效率可以通过不同方法进行监测。其中一种方法是使用微孔板读板机测量荧光。这样可以评估每个检测孔中的总体荧光水平,但无法得出转染细胞的百分比。评估转染效率的一种更有效方法是使用成像细胞仪来分析细胞,这种方法可以将表达可检测荧光的细胞数与细胞总数进行比较。成像细胞仪还有另一个优势,即能够在转染之前计算细胞融合度,因此这些信息可用作测定开发的一部分。
使用蛋白印迹法验证 CRISPR 编辑的细胞
CRISPR 基因编辑技术要求对整个过程进行仔细监测,以确保结果的准确性。SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机可提供完整解决方案来分析 CRISPR 编辑实验(从初始转染到确认蛋白敲减)的结果。使用 MiniMax 细胞仪,研究人员可以通过比较无标记细胞总计数与表达荧光的转染细胞计数来评估转染效率。ScanLater 蛋白印迹检测系统能够对对照细胞和 CRISPR 编辑细胞中的目标蛋白进行灵敏检测和定量分析。
前沿资源
基因编辑的资源
科学海报
Automated workflow for screening of CRISPR-edited cell lines. High throughput screening and analysis of monoclonality.
用于筛选 CRISPR 编辑细胞系的自动化工作流程。高通量筛选和单克隆性分析。
基因编辑使我们能够使用多种工具通过缺失、添加或其他修饰来操控脱氧核糖核酸 (DNA)。有许多有效的策略可进行这些修饰……
新闻中心
Molecular Devices partners with SEED Biosciences to exclusively offer DispenCell Single-Cell Dispenser, expanding leadership in cell line development
Molecular Devices 携手 SEED Biosciences 专门提供 DispenCell 单细胞分配器,从而扩大了在细胞系开发方面的领导地位
与现有解决方案相比,该技术使科学家能够以三倍速度分离单细胞系,而且成本更低 加利福尼亚州圣何塞,2023 年 2 月 7 日 – Molecular Devices, LLC.,一个……
文献
Gene editing in organoids: accounting for complexity in drug discovery
类器官中的基因编辑:考虑药物发现的复杂性
越来越多的研究人员正使用基因编辑来构建疾病模型,以更好地说明人体组织的复合生物学,这标志着 2D 细胞培养或动物模型到类器官……
应用文章
Automation of the CRISPR-based cell line development workflow
基于成簇规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 的细胞系开发工作流程的自动化
制药领域对更快高通量细胞系开发和更佳筛选的需求增加,这就促使研究机构和公司自动化现存的……
电子书
How to Implement Colony Picking Workflows with Automation
如何实施自动化克隆拣选工作流程
克隆拣选技术是哺乳动物细胞系开发和微生物学研究工作流程中的一个强大工具。
应用文章
CloneSelect Imager FL fluorescence for rapid day zero monoclonality
CloneSelect?Imager 细胞生长分析系统 FL 荧光可实现第零天快速确定单克隆性
基因编辑可进行 DNA 操纵,即使用不同工具添加、删除或修改。现有多种用于基因组编辑的核酸酶:锌指核酸酶 (ZFN)......
应用文章
Accelerating Gene Edited Cell Lines with the CloneSelect Imager FL
使用 CloneSelect Imager FL 加速基因编辑细胞系开发
基因编辑技术允许在 DNA 层面进行操作,并使用不同工具删除、增加或改变 DNA。
新闻中心
Molecular Devices continues investment in Organoid Innovation Center adding cell engineering capabilities to automated 3D cell culture platform
Molecular Devices 不断投资类器官创新中心,为自动化 3D 细胞培养平台增加了细胞工程能力
新一代 3D 生物学实验室计划研究干细胞,干细胞能够分化并自组装成筛选可重现性和一致性均更高的类器官模型 加利福尼亚州圣何塞,20 年 4 月 12 日……
博客
Life Science and Technology Predictions for 2022
2022 的生命科学技术预测
三十多年来,Molecular Devices 通过其创新生命科学……助力学术、制药、政府和生物科技客户取得了诸多科学突破
新闻中心
Gold Sponsor Molecular Devices at Society for Laboratory Automation and Screening 2022 International Conference and Exhibition
实验室自动化与筛选协会的金牌赞助商 Molecular Devices 2022 国际会议与展览
展示新的单克隆验证成像平台、教育海报和教程以及行业合作,以获得高级生命科学发现 加利福尼亚州圣何塞,2 月 3 日……
新闻中心
Molecular Devices launches next-gen monoclonal verification imaging platform for automatic, day zero monoclonality assurance
Molecular Devices 推出新一代单克隆验证成像平台,以保证自动化、零日单克隆性
CloneSelect® Imager FL 可提供无缝端到端工作流程,适用于:高速非标记和多通道荧光全孔图像采集 智能数据分析单克隆性……
科学海报
Improving the robustness of Cell Painting with a near-infrared label and advanced image and data analytics
通过近红外标签和高级图像和数据分析提高细胞全景绘制 (Cell Painting) 的稳健性
基于图像的表型剖析方法(如广泛使用的细胞全景绘制 [Cell Painting] 检测)利用高内涵成像和多参数读取来考察生物、遗传和化学……
科学海报
Simplified workflow for phenotypic profiling based on the Cell Painting assay
简化基于 Cell Painting 的表型分析的工作流程
细胞全景绘制 (Cell Painting) 检测等多参数高内涵筛选方法越来越多地用于药物发现计划、功能基因组学……等许多应用
博客
Get to know our Field Applications Scientist: Dwayne Carter
了解我们的现场应用科学家:Dwayne Carter
Dwayne Carter 带我们领略了 3D 生物打印、克隆筛选和加勒比美食。Dwayne Carter 是一名细胞生物学家和教育家,于 2020 年 11 月加入了 Molecular Devices......
博客
Life sciences technology predictions for 2021
2021 生命科学技术预测
40 多年来,Molecular Devices 一直处于技术进展的前沿,而这些技术进展促成了重大的科学突破。为迎接新的一年,我们……
应用文章
A microfluidics-based, single cell printing and microplate imaging workflow optimized for efficiency, viability and monoclonality report generation
基于微流控的单细胞分离与微孔板成像组合提高细胞株筛选的效率
在本应用文章中,我们展示了一个结合单细胞接种和单克隆性验证的整合工作流程。我们联合使用 SCP 和 CSI 来将单细胞分离在……
科学海报
Validating Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 Genomic Editing Experiments Using Molecular Devices Instruments
使用 Molecular Devices 的仪器验证成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/Cas9 基因组编辑实验
CRISPR/Cas9 基因编辑系统是一个用来研究基因功能的非常受欢迎的工具,因为它相对容易使用且准确。此外,该系统还具有处理…
应用文章
Validate CRISPR-Edited Cells using Imaging and Western Blot Detection on a Microplate Reader
使用微孔读板机(酶标仪)上的成像和蛋白质印迹检测来验证 CRISPR 编辑的细胞
基因组编辑已广泛用于研究基因表达和蛋白功能,但其中许多方法还需大量借助人力而且并不准确。CRISPR(规律成簇间隔…
应用文章
Confident assurance of clonality using calcein AM with minimal effect on viability
使用对活性影响小的 Calcein AM 来确证单克隆性
开发可表达特定目标蛋白的细胞株对于产生单克隆抗体等生物制药分子来说至关重要。建立一个细胞…
科学海报
Rapid Screening and Selection of Stable High Producing Clones
快速筛选和选择稳定高产克隆
筛选稳定高产的细胞株是开发和生产新蛋白制剂的关键限速步骤。
应用文章
Automated Optimization of IgG Production in CHO Cells
自动优化 CHO 细胞中的 IgG 生产
长期以来,单克隆抗体一直是细胞和分子检测的重要工具,并且已引入临床,作为小分子转换为生物治疗的一部分…
应用文章
PMT Adjustment in GenePix 4000B
GenePix 4000B 的 PMT 调节
GenePix 4000B 使用两种激光来激发 Cy3 和 Cy5 等荧光基团,并使用一对高灵敏度、低噪音的光电倍增管 (PMT) 来检测发射的荧光……
应用文章
Enhanced development of virus-specific hybridomas using ClonePix and CloneSelect Imager Technologies
使用 ClonePix 和 CloneSelect Imager技术促进病毒特异性杂交瘤细胞的开发
ClonePix 系统用于从亲代杂交瘤物质中高通量地筛选数百种亚克隆的细胞克隆(一直以来,亲代细胞株产量均不到 1 mg/…
应用文章
Optimizing GFP transfection with the SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform
使用 SpectraMax i3 多功能检测平台优化 GFP 转染
绿色荧光蛋白 (GFP) 等荧光蛋白的表达常用作报告基因检测的读数。在典型的报告基因检测中,调控序列…