基因编辑(成簇规律间隔短回文重复序列 [CRISPR]/Cas9)

自动化解决方案可增加通过 CRISPR 改造进行基因编辑的希望

什么是基因编辑?

基因编辑是一种可删除、插入、替换或改变活体基因组 DNA 的基因操作。基因编辑具有位点特异性靶向性,可通过各种技术使 DNA 断裂,但并不一定涉及修复机制。它包括两种技术,即失活和矫正。

失活是指靶基因转变,矫正可通过基因断裂促进缺陷基因的修复。基因编辑在无数领域中拥有巨大潜力,包括药物开发、基因手术、动物模型、疾病研究和治疗、食物、生物燃料、生物材料合成等。

虽然 CRISPR 是一种近年来广泛应用的主要基因编辑技术,但人们对基因编辑的研究始于 20 世纪后期。自从 CRISPR 这个原本雄心勃勃的应用问世以来,基因治疗已成为基因编辑中备受欢迎的应用。可以通过基因添加和基因编辑两种方法实现,其中基因添加可在现有遗传物质上进行添加以弥补有缺陷或缺失的基因,而基因编辑则可通过直接修改疾病相关的 DNA 来治疗疾病。

CRISPR/Cas9 机制

CRISPR/Cas9 机制。通过先结合导向 RNA,再结合紧挨在 3-核苷酸 PAM 序列之前的匹配基因组序列来激活 Cas9 酶。然后,Cas9 酶会引起双链断裂,并通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向重组 (HDR) 途径修复 DNA,从而形成编辑后的基因序列。

设计一种与 crRNA 相似的导向 RNA (gRNA) 来靶向基因中的某个区域,Cas9 酶可以在宿主细胞基因组的这个特定区域中引起双链断裂(图 1)。双链断裂发生后,细胞将采用两种修复途径中的一种:非同源末端连接 (NHEJ) 途径或同源定向重组 (HDR) 途径。NHEJ 途径常用于通过碱基插入或删除 (indels) 来扰乱基因,而 HDR 途径可用于通过在两个相似或相同的 DNA 分子之间交换序列来敲入报告基因或编辑序列。

通过 CRISPR 改造扩大基因编辑规模

“CRISPR” – 成簇规律间隔短回文重复序列。这些 DNA 序列最初被发现是细菌和古生菌等原核生物免疫系统的一部分,并自 2012 年以来成为重要的基因编辑工具(Jinek 等人,2012 年)。它在无数应用中拥有广阔的前景,包括农业、疾病建模、基因治疗和药物发现等等。它的准确性使之成为 DNA 序列插入(敲入)、删除(敲除)和其他修改的理想工具。它已在很大程度上取代了 TALENS 和 ZFNS 等繁琐且昂贵的现有基因编辑工具。

CRISPR 序列包含既往病毒入侵者的 DNA(称为各回文重复序列后的间隔区),这些序列有助于检测和破坏未来相似的病毒。了解这一机制(Jinek 等人,2012 年)后,在真核细胞中首次使用了 CRISPR(Cong, L 等人,2013 年),随后在其他细胞类型和不同领域的生物体中使用。CRISPR – Cas9 系统有两种主要成分,可形成核糖核蛋白复合物。第一种成分或导向 RNA 会结合基因组中的互补 DNA 序列,第二种成分,即源自酿脓链球菌的 Cas9 (SpCas9),会在目标位点处引起双链断裂。前间区序列邻近基序 (PAM) 是最初结合核酸酶并发生上游切割的位置。不同的 CRISPR 核酸酶具有不同的 PAM 位点,切割发生后,细胞修复系统被激活并且对基因组的编辑也会启动。

基因编辑工作流程

采用 CRISPR 机制以获得确认编辑细胞系的基因编辑工作流程有多个步骤。使用合适的工具对这些步骤进行有效优化,有助于有效减少取得各种科学进展所需的时间、精力和成本。这种方法有助于加快研发,并彻底改变药物发现、疾病治疗、基因编辑的剪切生产等。我们对涉及的步骤和所提供的有效解决方案进行讨论,以支持全球科学界通过基因编辑将他们的努力付诸实践。

验证 CRISPR/Cas9 基因编辑的研究解决方案

Molecular Devices 的仪器系列可有效用于执行/筛选实验,从而确保基因编辑工作取得成功。全新的 CloneSelect Imager Florescence (CSI-FL) 可在获取单细胞打印、转染效率、细胞融汇和多通道荧光筛选数据后保证第 0 天的单克隆性,以便在更短的跟踪时间内和较低的过传代风险下采用机器人技术来验证基因编辑的有效性。

此外,我们的 SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机可用于评估转染效率、监测细胞生长、定量测定 DNA 和蛋白,并通过 ScanLater 蛋白印迹分析验证 CRISPR/Cas9 编辑。使用 ImageXpress 显微共聚焦系统可以获得高品质的自噬体图像,同时 MetaXpress HCI 软件可识别和定量测定每个细胞中的单个自噬体,从而使我们能够分析 CRISPR/Cas9 基因编辑中发生的表型变化。

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