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基因编辑(成簇规律间隔短回文重复序列 [CRISPR]/Cas9)

自动化解决方案可增加通过 CRISPR 改造进行基因编辑的希望

什么是基因编辑?

基因编辑是一种可删除、插入、替换或改变活体基因组 DNA 的基因操作。基因编辑具有位点特异性靶向性,可通过各种技术使 DNA 断裂,但并不一定涉及修复机制。它包括两种技术,即失活和矫正。

失活是指靶基因转变,矫正可通过基因断裂促进缺陷基因的修复。基因编辑在无数领域中拥有巨大潜力,包括药物开发、基因手术、动物模型、疾病研究和治疗、食物、生物燃料、生物材料合成等。

虽然 CRISPR 是一种近年来广泛应用的主要基因编辑技术,但人们对基因编辑的研究始于 20 世纪后期。自从 CRISPR 这个原本雄心勃勃的应用问世以来,基因治疗已成为基因编辑中最受欢迎的应用。可以通过基因添加和基因编辑两种方法实现,其中基因添加可在现有遗传物质上进行添加以弥补有缺陷或缺失的基因,而基因编辑则可通过直接修改疾病相关的 DNA 来治疗疾病。

CRISPR/Cas9 机制

CRISPR/Cas9 机制。通过先结合导向 RNA,再结合紧挨在 3-核苷酸 PAM 序列之前的匹配基因组序列来激活 Cas9 酶。然后,Cas9 酶会引起双链断裂,并通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向重组 (HDR) 途径修复 DNA,从而形成编辑后的基因序列。

设计一种与 crRNA 相似的导向 RNA (gRNA) 来靶向基因中的某个区域,Cas9 酶可以在宿主细胞基因组的这个特定区域中引起双链断裂(图 1)。双链断裂发生后,细胞将采用两种修复途径中的一种:非同源末端连接 (NHEJ) 途径或同源定向重组 (HDR) 途径。NHEJ 途径常用于通过碱基插入或删除 (indels) 来扰乱基因,而 HDR 途径可用于通过在两个相似或相同的 DNA 分子之间交换序列来敲入报告基因或编辑序列。

通过 CRISPR 改造扩大基因编辑规模

“CRISPR” – 成簇规律间隔短回文重复序列。这些 DNA 序列最初被发现是细菌和古生菌等原核生物免疫系统的一部分,并自 2012 年以来成为重要的基因编辑工具(Jinek 等人,2012 年)。它在无数应用中拥有广阔的前景,包括农业、疾病建模、基因治疗和药物发现等等。它的精确性使之成为 DNA 序列插入(敲入)、删除(敲除)和其他修改的理想工具。它已在很大程度上取代了 TALENS 和 ZFNS 等繁琐且昂贵的现有基因编辑工具。

CRISPR 序列包含既往病毒入侵者的 DNA(称为各回文重复序列后的间隔区),这些序列有助于检测和破坏未来相似的病毒。了解这一机制(Jinek 等人,2012 年)后,在真核细胞中首次使用了 CRISPR(Cong, L 等人,2013 年),随后在其他细胞类型和不同领域的生物体中使用。CRISPR – Cas9 系统有两种主要成分,可形成核糖核蛋白复合物。第一种成分或导向 RNA 会结合基因组中的互补 DNA 序列,第二种成分,即源自酿脓链球菌的 Cas9 (SpCas9),会在目标位点处引起双链断裂。前间区序列邻近基序 (PAM) 是最初结合核酸酶并发生上游切割的位置。不同的 CRISPR 核酸酶具有不同的 PAM 位点,切割发生后,细胞修复系统被激活并且对基因组的编辑也会启动。

基因编辑工作流程

采用 CRISPR 机制以获得确认编辑细胞系的基因编辑工作流程有多个步骤。使用合适的工具对这些步骤进行有效优化,有助于有效减少取得各种科学进展所需的时间、精力和成本。这种方法有助于加快研发,并彻底改变药物发现、疾病治疗、基因编辑的剪切生产等。我们对涉及的步骤和所提供的有效解决方案进行讨论,以支持全球科学界通过基因编辑将他们的努力付诸实践。

验证 CRISPR/Cas9 基因编辑的研究解决方案

Molecular Devices 的仪器系列可有效用于执行/筛选实验,从而确保基因编辑工作取得成功。全新的 CloneSelect Imager Florescence (CSI-FL) 可在获取单细胞打印、转染效率、细胞融汇和多通道荧光筛选数据后保证第 0 天的单克隆性,以便在更短的跟踪时间内和较低的过传代风险下采用机器人技术来验证基因编辑的有效性。

此外,我们的 SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机可用于评估转染效率、监测细胞生长、定量测定 DNA 和蛋白,并通过 ScanLater 蛋白印迹分析验证 CRISPR/Cas9 编辑。使用 ImageXpress 显微共聚焦系统可以获得高品质的自噬体图像,同时 MetaXpress HCI 软件可识别和定量测定每个细胞中的单个自噬体,从而使我们能够分析 CRISPR/Cas9 基因编辑中发生的表型变化。

  • 加快基因编辑细胞系开发

    加快基因编辑细胞系开发

    了解全新的 CloneSelect® Imager FL 如何帮助轻松检测成功转染的细胞,缩短细胞系开发时间以及更快扩大您的研究规模。在早期阶段废弃低转染效率池,使用多通道荧光检测来确认和跟踪各种 CRISPR 编辑,使用机器人重设计准确且自信地筛选细胞,同时降低过传代干扰的风险。

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    克隆产量筛选和滴度

    克隆产量筛选和滴度

    识别优质克隆的一个重要步骤是测定单细胞来源克隆的表达量。使用传统方法筛选产率费力且耗时,通常包含多个步骤,涉及从有限稀释中分离单细胞之后再用 ELISA 进行滴度评估。ClonePix 2 系统将表型选择、单细胞分离和产率筛选合为一个步骤,因此可明显缩短筛选时间并增加候选物数量。

  • 使用钙黄绿素 AM 来确证克隆性

    使用钙黄绿素 AM 来确证克隆性

    使用对活性影响小的 Calcein AM 来确证单克隆性

    在此,我们展示了一个优化的工作流程,其中将荧光试剂(钙黄绿素 AM)和显示出与无标记状态相似的活性,同时还能提供较高的克隆性确证度,并且具有荧光功能的 CloneSelect™ Imager成像仪结合使用。

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    CRISPR/Cas9 基因组编辑实验

    CRISPR/Cas9 基因组编辑实验

    CRISPR/Cas9 基因编辑系统是一个用来研究基因功能的非常受欢迎的工具,因为它相对容易使用且准确。此外,该系统还在治疗遗传性疾病方面具有巨大的潜力。为了确保目标基因被成功敲减或敲除,必须对 CRISPR/Cas9 基因编辑进行验证。在这里,我们通过使用 CRISPR/Cas9 敲减 HEK293 细胞中的自噬相关蛋白 5 (ATG5) 来演示 Molecular Devices 的仪器系列如何用于基因编辑实验。

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  • 单克隆性

    单克隆性保证

    细胞株开发和单克隆性验证是生产生物制药分子(如单克隆抗体)的过程中的关键步骤。在分离稳定表达目标蛋白的单个活细胞后,可建立细胞株。此过程中的一个关键结点是记录单克隆性证据。单克隆性证据通常都是图像形式,据此可生成单细胞图像并将其随附在监管文件中。

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    单细胞分选

    单细胞分选

    细胞株开发就是发现源自单个细胞的克隆,其可稳定高表达目标治疗性蛋白。此过程的第一步是分离活的单细胞。有限稀释是一种依赖于统计概率的技术,但很耗时。CloneSelect Single-Cell Printer 能够以尽量提高细胞活性的方式来温和分离细胞,同时通过在细胞分配时捕获的 5 张图像系列来提供克隆性的直接证据。

  • 转染效率

    转染效率

    荧光报告基因的转染效率可以通过不同方法进行监测。其中一种方法是使用微孔板读板机测量荧光。这样可以评估每个检测孔中的总体荧光水平,但无法得出转染细胞的百分比。评估转染效率的一种更有效方法是使用成像细胞仪来分析细胞,这种方法可以将表达可检测荧光的细胞数与细胞总数进行比较。成像细胞仪还有另一个优势,即能够在转染之前计算细胞融合度,因此这些信息可用作测定开发的一部分。

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    使用蛋白印迹法验证 CRISPR 编辑的细胞

    使用蛋白印迹法验证 CRISPR 编辑的细胞

    CRISPR 基因编辑技术要求对整个过程进行仔细监测,以确保结果的准确性。SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机可提供完整解决方案来分析 CRISPR 编辑实验(从初始转染到确认蛋白敲减)的结果。使用 MiniMax 细胞仪,研究人员可以通过比较无标记细胞总计数与表达荧光的转染细胞计数来评估转染效率。ScanLater 蛋白印迹检测系统能够对对照细胞和 CRISPR 编辑细胞中的目标蛋白进行灵敏检测和定量分析。

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