G 蛋白偶联受体 (GPCR)

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G 蛋白偶联受体 (GPCR)

G 蛋白偶联受体 (GPCR) 是位于细胞表面的蛋白，能够识别出胞外物质并跨细胞膜传递信号。GPCR 会激活负责细胞内信号转导的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G 蛋白）来传递信号。信号传递在各种细胞反应中都非常重要，包括细胞生长、基因转录、翻译后变化和与其他细胞通信。这样会引起体内调整以适应环境变化，如感觉受到威胁时心率加快，或光线昏暗时视觉发生改变。

仅人类基因组就包含至少 1,000 种不同的 GPCR，这些 GPCR 可检测激素、脂类、胺类、神经递质和光等。

GPCR 由三个区域组成。首先，胞外部分可检测并结合配体。其次，七次跨膜区域会发生构象变化。最后，这种变化会激活可触发相应 G 蛋白的羧基末端。

由于代表各种基因表达谱并具有与天然心肌细胞相似的表型鉴定特征，iPS 细胞源性心肌细胞成为备受关注的细胞模型。

G 蛋白偶联受体和离子通道

GPCR 是较大的蛋白家族，有 600 - 1000 个成员，并且已证实与许多正常生物学状况和病理学状况相关。它们也属于七次跨膜 (7-TM) 受体，并且大约 45% 的现代药物会以该蛋白作为目标靶点。GPCR 的功能极其多样，可识别各种不同的配体，包括光子、小分子和蛋白。

离子通道是细胞膜中可让离子进出细胞的孔道。人类基因组中有超过 400 个离子通道基因。它们中有很多已成为风靡当下的药物的靶标，可以使用如膜片钳技术的传统电生理学设备对离子通道活性进行直接测量，但其通量非常低。使用对膜电位改变敏感的荧光基团、钙流和钾流也可间接测定离子通道活性且通量更高。

监测 GPCR 活性以进行药物发现

GPCR 活性变化会引起细胞信号传导通路异常，从而导致炎症、心血管疾病、精神障碍、激素失衡和癌症。这就是 GPCR 成为药物发现核心的原因，由 FDA 认可的所有药物中，约有 34% 均靶向 108 种已明确的 GPCR。

在药物发现中，可使用各种测定法来监测 GPCR 活性和相应的细胞内变化。

钙是 GPCR 活性触发的一个重要信使，因此，细胞内钙信号传导变化是 GPCR 活化状态的重要指标。钙流检测可在药物筛选中监测细胞内钙水平。

监测钙振荡对预测候选药的体外毒性同样至关重要。

环磷酸腺苷 (cAMP) 是参与信号传导通路的另一个重要信使。细胞内 cAMP 水平变化表明存在特异性 GPCR-G 蛋白偶联，从 cAMP 检测中可以获得有关 GPCR 亚型的重要信息。

还可以通过 Transfluor 检测来监测 GPCR 活性，主要关注点放在 GPCR 结合配体后出现失敏。这些检测可用于药物筛选，以监测 GPCR 激活/失活和跨细胞膜移动。

检测 GPCR 早期先导物的解决方案

我们可提供各种检测和仪器解决方案来支持 GPCR 和离子通道功能研究，包括检测试剂盒、细胞筛选和成像系统以及微孔板读板机。

在这里，我们关注于使用 FLIPR 高通量细胞筛选系统、Screenworks Peak Pro 2 软件模块以及各种 FLIPR 检测试剂盒的应用，以便提供用于毒理学和先导化合物识别的高通量动力学筛选解决方案。

心肌细胞
心脏毒性：钙振荡
钙流评估
Fura-2 QBT 钙
适用于 G 蛋白偶联受体检测的均相解决方案
活细胞 Gi 和 Gs 偶联 GPCR 第二信使信号传导
活细胞动力学检测
测量细胞内钙流
监测 Gq 偶联的蛋白受体活性
神经元检测

心肌细胞

药物诱导的功能性心脏毒性的早期预测需要高通量筛选的可靠体外系统。现成的 iPSC 源性人心肌细胞可与钙敏感染料联合使用，并且可随着细胞内钙离子对 GPCR 和离子通道的反应变化来监测搏动频率和模式。这些钙峰可使用我们的 ScreenWorks Peak Pro 2 软件来分析，该软件是一套可为研究者定量心肌细胞活性的强大工具。

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心脏毒性：钙振荡

诱导多能干细胞 (iPSC) 源性心肌细胞可用于评估化合物对心脏功能和安全性的影响，因而是一个备受关注的体外模型系统。钙信号振荡可反映细胞质钙浓度的变化，因此可以使用 EarlyTox^™ 心脏毒性试剂盒等钙敏感染料。

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钙流评估

对钙流的评估是长期被认可、可靠且真实的对细胞活性的检测。钙流可用作众多细胞进程的量度，包括神经递质释放、GPCR 活性、配体门控离子通道以及心肌细胞搏动模式等。FLIPR 系统是一种药物发现工具，由于具备易用性、灵敏度和用户可配置性，因而可在高通量和超高通量筛选中用来评估钙流。

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Fura-2 QBT 钙

Fura-2 染料一直被视为是一款在细胞成像、GPCR 介导的细胞内钙流以及离子通道活化条件下测量钙动力的重要工具。通过计算结合指示剂与游离指示剂之间的荧光强度比，这种比率测定的染料有助于纠正染料上样或细胞铺板存在的检测差异。然而，必须要进行洗涤，因此对每项检测而言均增加了孔间变异性、延长了时间并增加了复杂性。

Molecular Devices 的 Fura-2 QBT™ 钙离子检测试剂盒将久经验证的淬灭技术与比率测定的 Fura-2 钙指示剂相结合，提供了同质检测，可较大程度地减少基于细胞的变异性，同时通过去除检测前的细胞洗涤步骤来增加通量。

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适用于 G 蛋白偶联受体检测的均相解决方案

在早期药物发现过程中，细胞检测已成为筛选和化合物分析方面不可或缺的方法。迄今为止，此类检测已被证明是受体特性鉴定研究、初步筛选活动和化合物分析程序中最可靠且可重复的方法。特别是对于 Gq 偶联的 G 蛋白偶联受体靶标，采用淬灭技术的均相荧光钙流检测是优选方法。

将新荧光团和久经验证的淬灭技术相结合，FLIPR 钙 5 检测试剂盒可提供可靠的药理学功能、更大的信号窗口，还可提高检测性能。通过 FLIPR 钙离子 5 检测试剂盒和 FLIPR 系统，可以一种易于使用的同质性形式对各种受体和靶标进行一致性筛选，尤其是钙信号反应较小的受体和靶标。

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使用 FLIPR 钙流 5 检测试剂盒的 GPCR 检测均相溶液

活细胞 Gi 和 Gs 偶联 GPCR 第二信使信号传导

通常使用放射性结合或需要进行细胞裂解的终点 cAMP 检测等方法，来完成对 G_i 和 G_s 偶联 GPCR 第二信使信号活性的检测。此类检测在细胞反应中的单个时间点测定活性，并且不提供动力学信息。另一选择是利用 G_i 和 G_s偶联的 G 蛋白偶联受体与 Gα16 的强制偶联，随后在激动剂受体激活后进行钙流荧光检测。同样，这种检测是次优的，因为它不通过生物相关的 cAMP 通路发出信号。

在这里，我们使用 FLIPR 系统展示了稳定表达 GloSensor^™ 质粒的 CHO-K1 和 HEK-293 细胞系的内生受体活性。

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FLIPR Tetra 系统上活细胞 Gi 和 Gs 偶联的 GPCR 第二信使信号传导

活细胞动力学检测

ImageXpress Confocal 和 Micro 4 高内涵成像系统提供可选移液系统和环境控制模块，可在快速动力学或扩展延时实验中实现用于添加化合物或交换培养基的单通道移液。Transfluor GPCR 细胞检测试剂盒是一个在高内涵筛选 (HCS) 期间使用的重要工具，可用于使用 GFP 标记的 ß 抑制蛋白和自动成像分析，通过定量 GPCR 脱敏和循环来追踪 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 激活。

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利用 ImageXpress Micro 高内涵成像系统对活细胞动力学进行测定

测量细胞内钙流

G 蛋白偶联受体 (GPCR) 在细胞信号转导方面起着重要作用。当受体被配体激活时，受体构象就会改变，从而触发细胞内 G 蛋白的激活。激活 G 蛋白具有诱导各种胞内信使（包括钙）级联反应能力。FLIPR 系统可实现高通量的功能性细胞水平测定，它是药物发现中的优选系统，适用于评估通过使用荧光钙敏感报告基因染料检测到的细胞内钙变化。在这里，我们提供在 FLIPR 系统上使用 FLIPR® 钙流检测试剂盒（一种同质、迅速且可靠的荧光检测）进行钙动力检测的基本方案。

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使用 FLIPR 钙检测试剂盒比较细胞内钙测量

监测 Gq 偶联的蛋白受体活性

通常，在高通量实时荧光检测分析系统 (FLIPR) 上使用钙敏感染料可在活细胞中实时监测到 Gq 蛋白偶联受体激活。FLIPR的自动液体处理通常需要将激动剂化合物输送至微孔板中的细胞，而检测系统则对由化合物诱导的荧光强度变化进行实时读取。对生成的动力学读数进行分析可得出关于化合物反应特征的信息，包括激动剂和拮抗剂的 EC₅₀ 和 IC₅₀ 值。

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在配有注射器卡盒的 SpectraMax i3x 微孔板读板机（酶标仪）上监测 Gq 蛋白偶联受体活化过程

神经元检测

FLIPR 系统是一款用于监测神经元活性相关钙流的出色工具。新开发且市面上可买到的 iPSC 神经元系统可实现高通量的神经元筛选。这些细胞和检测对于监测包括神经细胞培养条件、药物复合作用以及环境神经毒素的影响在内的各种不同因素而言十分重要。可通过结合基于荧光原理的钙指示剂染料与通量规模可调且快捷简便的强大测定法来评估神经活动和神经递质释放。

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